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            云序客戶Mol Cancer成果|教您如何發外泌體10分文章
            2020年3月20日，云序客戶上海交通大學附屬第一人民醫院田聆教授課題組在高 分期刊Moleular Cancer雜志（影響因子10.679）發表了關于外泌體在胰腺ai腫 瘤再生長中的研究。
            文章導讀
            2020年3月20日，云序客戶上海交通大學附屬第一人民醫院田聆教授課題組在高 分期刊Moleular Cancer雜志（影響因子41.44）發表了關于外泌體在胰腺ai腫 瘤再生長中的研究。腫 瘤再生長是放射治 療失敗的主要原因。以往的研究表明，死亡的腫 瘤細胞通過促進殘留的腫 瘤再生細胞(TrCs)的增殖，在腫 瘤再增殖過程中起著至關重要的作用。然而，TRCs在放療后也會遭受DNA損傷，并可能在垂死細胞釋放的增殖因子的刺激下發生有絲分裂錯誤。因此，本研究打算找出這些自相矛盾的生物學過程是如何發生的，以降低放療后腫 瘤的再增殖可能。接下來，小編就帶大家一起解讀這篇高 分文章。
            
	 Mol. Cancer 
	
            

            
	 Mol. Cancer 

            

            發表期刊：Mol. Cancer
            影響因子：41.44
            發表日期：20200320
            實驗方法：全轉錄組測序、外泌體miRNA測序（云序提供測序服務）
            文獻鏈接：Dying tumor cell-derived exosomal miR-194-5p potentiates survival and repopulation of tumor repopulating cells upon radiotherapy in pancreatic cancer
             文章內容
            （1）受輻射的垂死腫 瘤細胞釋放的外泌體可動態增強腫 瘤的繁殖
            首先作者通過相關研究證明受輻射的垂死腫 瘤細胞分泌的外泌體在輻射后期會促進增殖。為了弄清原理，作者對輻射前后的胰腺ai細胞進行了全轉錄組測序（本實驗云序提供）。并進行了GO分析，發現差異基因多富集在與細胞外囊泡和外泌體調控有關的條目中（圖1a）。接著作者進一步研究發現，與未輻照的胰腺ai細胞相比，輻照過的胰腺ai細胞的外泌體釋放量增加（圖1b）。為了驗證外泌體在存活的腫 瘤細胞中的直接作用，作者在體外進行了菌落形成試驗。放射后，用垂死的腫 瘤細胞來源的外泌體處理的ai細胞的集落形成能力顯著增強（圖1g）。結果表明，來自垂死的腫 瘤細胞的外泌體可以促進放射后的細胞存活。
            作者進一步探討了外泌體對胰腺ai的作用，作者在胰腺ai異種移植（PDX）小鼠模型中進行了體內實驗。發現輻照的PDX腫 瘤能加速種群重現（圖1h）。當PDX小鼠同時用GW4869（外泌體抑 制劑）治 療時，腫 瘤的種群顯著減慢（圖1h），小鼠的生存時間延長了（圖1i）。這些結果表明，垂死的腫 瘤細胞來源的外泌體促進了腫 瘤的重新聚集。
            
	 受輻射的垂死**細胞釋放的外泌體可以動態增強**的繁殖 
	
            

             圖1：受輻射的垂死腫 瘤細胞釋放的外泌體可以動態增強腫 瘤的繁殖 

            

            （2）垂死的腫 瘤細胞釋放的外泌體增強了ALDH1A1+ TRC的存活
            作者認為腫 瘤再生細胞（TRC）可能是外泌體的主要受體。由于目前沒有辦法鑒定TRC，因此作者收集了放射后存活的胰腺ai細胞，并通過高通量測序分析了ai癥干細胞相關基因的表達譜。發現與未輻射的對照組相比，有62個基因表達被上調， 值得注意的是，輻射后ALDH1A1的表達顯著上調（圖2a）。眾所周知，ALDH1A1是胰腺ai干樣細胞重要的標志物之一。ALDEFLOUR?實驗表明，放射后存活的ai細胞和原發性胰腺腫 瘤細胞中ALDH +細胞的比例顯著提高（圖2b-c）。qPCR分析和Western印跡表明，ALDH1A1的表達在受輻照的胰腺ai細胞和PDX腫 瘤組織中表達上調（圖2d）。免疫組織化學（IHC）染色進一步顯示，ALDH1A1+細胞在PDX腫 瘤組織中照射后高度富集（圖2e）。但是，GW4869顯 著抑 制了ALDH1A1+細胞的積累（圖2e），這表明外泌體可能會促進ALDH1A1 +細胞的存活。
            此外，作者檢查了垂死的腫 瘤細胞對TRC的直接保護作用。當與受輻照的胰腺ai細胞共培養后，受輻照的細胞表現出明顯更高的存活率（圖2g-h）。如圖所示，輻射細胞分離的外泌體顯 著提高了細胞的存活率（圖2h）。以上結果表明，在放療中垂死腫 瘤細胞分泌的外泌體能提高ALDH1A1+ TRC的存活率。
             垂死的腫 瘤細胞釋放外泌體增強了ALDH1A1 + TRC的存活  
	
            

             圖2：垂死的腫 瘤細胞釋放外泌體增強了ALDH1A1 + TRC的存活 

            

            （3）外泌體通過促進DNA損傷反應增強TRC的存活
            接著，作者探討了垂死的腫 瘤細胞分泌的外泌體如何促進ALDH1A1+細胞的存活。H＆E染色顯示，PDX腫 瘤中的細胞在放射后14天呈現出較大的核，并具有明顯的異質性（圖3a），這表明了放射損傷的積累。輻射后50天，細胞恢復了活力，并恢復了“正?！钡募毎诵螒B。但是，GW4869處理后阻礙了腫 瘤細胞的恢復（圖3a）。值得注意的是，ALDH1A1+和γH2A.X雙重染色表明，輻射后，ALDH1A1+細胞也遭受了DNA損傷（圖3b）。在GW4869治 療組中，大多數ALDH1A1+細胞在放射后50天仍顯示出明顯的γH2A.X陽性灶（圖3b）。這些數據表明，輻射后TRC的存活涉及DNA損傷反應（DDR），該損傷由受輻射的垂死腫 瘤細胞的外泌體調節。
            此外，作者還探究了外泌體是否能直接促進體外輻射存活TRC的DDR。如示蹤細胞所示，輻射在ALDH1A1+和ALDH1A1-細胞中均引起DNA損傷（圖3c）。GW4869顯 著損害了ALDH1A1+細胞的修復，因為它們中的大多數在放射后3天仍攜帶γH2A.X陽性灶（圖3c）。此外，來自輻射的垂死腫 瘤細胞的外泌體顯 著加速了γ-H2A.X和pATM的衰減（圖3d）并降低了輻射細胞中DNA損傷（圖3e）?？傮w而言，這些結果表明，受輻射的垂死的腫 瘤細胞來源的外泌體通過促進DDR增強了TRC的存活。
              外泌體通過促進DDR增強TRC的存活 
	
            

             圖3：外泌體通過促進DDR增強TRC的存活 

            

            （4）外泌體miR-194-5p促進受損TRC的修復
            作為外泌體的重要內含物，作者推斷miRNAs可能在TRC的存活中起重要作用。因此，作者進行了對輻射前后的腫 瘤細胞外泌體進行了外泌體miRNA測序（本實驗云序提供），發現在垂死的腫 瘤細胞來源的外泌體中，兩個重要的miRNA，即miR-196b-5p和miR 194-5p顯著上調（圖4a）。前人研究表明，miR-194可能參與基因組穩定性。因此，作者將其作為目標分子，通過qPCR分析驗證了miR-194-5p在外泌體中的高表達（圖4b）。同樣，miR-194-5p mimics轉染的細胞在輻射后具有更強大的集落形成能力（圖4d）。此外，當使用強力霉素處理時，胰腺ai細胞的集落形成被顯 著抑 制。但是，如果強力霉素誘導后的胰腺ai細胞暴露于輻射中，則這些細胞的集落形成將顯 著增強（圖4e）。此外，miR-194-5p mimics在輻射的胰腺ai細胞中顯 著促進了γH2A.X和pATM的衰減（圖4f）和DNA損傷的減少。這些結果表明，外泌體miR-194-5p通過促進DDR促進了TRC的存活。
            為了進一步確定miR-194-5p的主要有效靶標，作者首先預測了它的靶基因，并對預測結果進行KEGG分析，預測目標中只有轉錄因子E2F3與細胞周期調控有關。E2F3是E2F家族的一員，已被廣 泛發現可促進ai癥的發生和發展。于是作者用雙重熒光素酶報告基因檢測證明E2F3是miR-194-5p的直接靶標（圖4g）。與miR-194-5p相反，E2F3過表達促進細胞周期進程和EdU摻入，并阻礙pATM和γH2A.X的衰減（圖4h）并減少受輻照的胰腺ai細胞中DNA的損傷。E2F3基因敲除提高了放射后胰腺ai細胞的集落形成能力，而miR-194-5p mimics的轉染并沒有進一步增強該能力（圖4i）。這些數據表明外泌體miR-194-5p抑 制E2F3誘導G1 / S阻滯并促進DNA損傷修復。
            先前的研究確定HMGA2和E2F3是胰腺ai的八個主要調節樞紐中的兩個，  作者發現HMGA2負調控miR-194-5p的表達（圖4j），并通過一系列實驗證明，HMGA2富含莖狀ALDH1A1+細胞，并且有助于胰腺ai的進展。但是，當胰腺ai細胞暴露于10Gy輻射時，HMGA2的過表達顯 著抑 制了這些細胞的集落形成能力（圖4k），而敲除HMGA2則增強了細胞存活和集落形成（圖4l）。HMGA2還阻礙了輻射的胰腺ai細胞中pATM和γH2A.X的衰減（圖4m）和DNA損傷?？傊?，這些數據表明，TRC中富集的HMGA2促進了干細胞的生長和ai癥進展，但潛在地損害了輻射的TRC的存活和恢復，而來自垂死的腫 瘤細胞的外泌體miR-194-5p瞬時逆轉了輻射下HMGA2的作用。
            外泌體miR-194-5p促進受損TRC的修復 
	
            

             圖4：外泌體miR-194-5p促進受損TRC的修復 

            

            （5）垂死的腫 瘤細胞釋放的PGE2促進TRC的增殖
            如前所述，垂死的腫 瘤細胞能促進報告細胞的增殖，這暗示著TRCs被除了外泌體miR-194以外的物質驅使加速了增殖。眾所周知，受輻射的垂死腫 瘤細胞還釋放了PGE2，這是一種脂質代謝產物，被認為是化學放療后腫 瘤重生的重要介質。因此，作者通過ELISA定量了受輻射的垂死胰腺ai細胞中的PGE2，發現放射后24小時PGE2含量保持不變，但在48小時略有升高，而在72小時顯 著增加（圖5a）。
            同樣，PGE2形成的關鍵酶PTGS2（COX-2）的表達也經歷了短暫的滯后階段，之后逐漸增加（圖5b-c）。而輻射后，胰腺ai細胞中，外泌體相關蛋白（如RAB27A，TSG101和CD9）的表達立即增加（圖5c）。值得注意的是，當COX-2的表達逐漸增加時，外泌體相關蛋白的表達減少（圖5c）。在PDX小鼠模型中，IHC染色還顯示，放射后不久，外泌體相關蛋白的表達升高，直到12天后下降，此時COX 2的表達開始顯 著上調（圖5d）。
            同時，發現 celecoxib（一種抑 制PGE2合成的COX-2抑 制劑）以劑量依賴性方式顯 著抑 制了腫 瘤細胞的繁殖（圖5e）。雖然PGE2可以加速腫 瘤細胞的增殖，但是在放射后立即向腫 瘤細胞中添加PGE2會反向抑 制細胞活力（圖5f）。值得注意的是，celecoxib處理并不會影響外泌體相關標志蛋白質的表達（圖5g）。這些結果表明，輻射的垂死腫 瘤細胞分泌的外泌體對于腫 瘤的再形成至關重要。
            綜上，這些結果表明，垂死的腫 瘤細胞釋放的外泌體和PGE2共同作用導致了腫 瘤的再增殖級聯反應，其中外泌體miR-194-5p首先抑 制細胞增殖以促進TRC的恢復，然后PGE2促進TRC的加速增殖。
            垂死的**細胞釋放的PGE2促進回收的TRC的增殖 
	
            

             圖5：垂死的腫 瘤細胞釋放的PGE2促進回收的TRC的增殖 

            

            （6）阿司匹林通過削弱垂死的腫 瘤細胞的分泌物來抑 制放療后的腫 瘤
            作者前期研究推測，阿司匹林可能具有抑 制胰腺ai中腫 瘤再增殖的潛力，前人研究也表名其會影響外泌體和miRNA。因此，作者首先在體外測試了阿司匹林治 療在腫 瘤細胞重塑模型中的作用。發現阿司匹林極大地抑 制了與輻射的垂死腫 瘤細胞共培養的報告細胞的增殖（圖6a），而當它們單獨培養時對報告細胞的增殖沒有影響。阿司匹林降低了輻射的胰腺ai細胞上清液中的PGE2含量（圖6b），并減少了細胞釋放的外泌體的量（圖6c）。此外，在阿司匹林處理過的輻射細胞衍生的外泌體中，miR-194-5p被下調（圖6d）。與*接受放射線處理的細胞分泌的外泌體相比，經阿司匹林處理的輻射細胞衍生的外泌體喪失了誘導G1 / S阻滯并減少EdU摻入的能力（圖6e-f）。因此，經阿司匹林處理的輻射細胞產生的外泌體在輻射后不能促進胰腺ai細胞的集落形成（圖6g）。
            接著，作者又在PDX小鼠模型中測試了阿司匹林治 療的效果。阿司匹林單一療法對PDX腫 瘤無治 療作用，單獨放療同樣無治 療作用（圖6h-i）。然而，阿司匹林治 療和放射療法的結合顯 著抑 制了腫 瘤的重新聚集并延長了荷瘤小鼠的存活時間（圖6h-i）。此外，阿司匹林損害了放療后腫 瘤組織的恢復，這與GW4869的作用相似。同時，阿司匹林還抑 制了放療后腫 瘤組織中ALDH1A1+ TRC的富集。這些數據表明，阿司匹林可抑 制胰腺ai放療后的腫 瘤再增殖。
            阿司匹林通過削弱垂死的腫 瘤細胞的分泌物來抑 制放療后的** 
	
            

             圖6：阿司匹林通過削弱垂死的腫 瘤細胞的分泌物來抑 制放療后的腫 瘤 

            

            總結
            

            總的來說，本研究通過全轉錄組測序（云序提供）和外泌體miRNA測序（云序提供），鑒定顯 著變化的miRNAs。并采用qPCR、Western blot、IHC、FACS、集落形成等實驗進行分子和細胞分析，發現垂死腫 瘤細胞來源的外泌體通過傳遞miR-194-5p誘導G1/S期阻滯，促進DNA損傷反應，提高TRCs的存活率，進而調節E2F3的表達。此外，外泌體miR-194-5P可減輕放療時致aiHMGA2的毒副作用。在潛伏一段時間后，垂死的腫 瘤細胞進一步釋放大量的PGE2來恢復TRCs的增殖，并協調了再增殖的級聯反應。值得注意的是，該研究發現小劑量阿司匹林可以通過抑 制外泌體和PGE2的分泌來抑 制胰腺ai放療后的再生長。
            阿司匹林破壞垂死腫 瘤細胞分泌的外泌體導致的腫 瘤再生級聯反應 
	
            

             圖7：阿司匹林破壞垂死腫 瘤細胞分泌的外泌體導致的腫 瘤再生級聯反應 

            

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