Hepatology文章| m6A甲基化在非酒精性脂肪肝病中的作用研究

非酒精性脂肪肝(NAFLD)的特征是過量積累肝細胞中TGs，而肥胖是脂肪肝的主要危險因素，m6A RNA修飾在肥胖相關NAFLD進展中的作用尚未被研究。本文作者利用 m6A-seq分別檢測正常肝臟組織（lean）和瘦素受體缺陷型小鼠肝臟組織（db/db）中mRNA m6A甲基化位點，發現在db/db組檢測到7307個m6A甲基化位點，lean組檢測到6377個m6A甲基化位點，兩組都檢測到共有的4070個m6A甲基化位點。RNA-seq & m6A-seq聯合分析進一步揭示了甲基化與基因表達關系，發現176個mRNA表達與甲基化程度呈高度正相關，同時GO和KEGG分析預測到差異甲基化基因富集脂肪酸代謝過程，特別是對甘油三酯合成至關重要的基因，如Seebp-1c、Fasn、Scd1、Acc1和Gpat1(甘油-3-磷酸?；D移酶1)，并利用m6A-merip-PCR和PCR技術分別證實這些基因的甲基化水平和表達水平，發現在db/db小鼠中這些基因m6A甲基化增強，同時其mRNA表達水平也升高?？傊?，這些結果表明mRNA的m6A修飾可能導致db/db小鼠肝臟中脂質基因的異常表達，促進肝臟的甘油三酯沉積。

圖4. m6A - seq和RNA- seq聯合分析鎖定靶分子

2. 鎖定研究閱讀器蛋白YTHDC2

為了揭示肥胖小鼠肝臟中m6A修飾水平發生變化的驅動力，作者檢測了調控m6A修飾相關酶的變化，發現在db/db小鼠肝臟中m6A甲基化識別蛋白YTHDF2表達升高，而YTHDC2表達明顯下調，而且從C57BL/6小鼠中分離得到的YTHDC2能在小鼠原代肝細胞中富集(MPHs)，此外YTHDC2*定位于肝細胞，因此作者選擇YTHDC2作為肥胖癥m6A修飾調節關鍵蛋白進行分析。進一步在db/db、ob/ob和 HFD小鼠體內都證實YTHDC2 在RNA和蛋白水平表達明顯下調，更重要是YTHDC2的RNA水平與體重呈負相關，同時YTHDC2的RNA表達水平與肝內甘油三酯含量也呈明顯負相關；實驗還發現肝臟中YTHDC2在NAFLD的發展過程中下調，與NAFLD疾病嚴重程度呈負相關，這些結果進一步說明YTHDC2對肝臟代謝的調控作用。

圖5. m6A 甲基化閱讀器YTHDC2相關表達

3. 閱讀器蛋白YTHDC2的上游調控

為了闡明肥胖時肝臟YTHDC2下調的病理生理因素，作者進一步探討了相關營養物質和促炎細胞因子在HepG2細胞中的作用。實驗結果發現棕櫚酸酯(PA)或高葡萄糖(Glu)抑 制了mRNA和蛋白，在小鼠來源的Hep1-6細胞中同樣觀測到PA和Glu對YTHDC2表達水平的影響?？傊?，這些結果表明在肥胖的肝臟中YTHDC2的表達降低部分是由于營養過剩造成的，換言之，肝臟YTHDC2的表達受葡萄糖和棕櫚酸鹽的調節。

圖6. 肝臟YTHDC2的表達受葡萄糖和棕櫚酸鹽的調節

4. 閱讀器蛋白YTHDC2對甘油三酯（TG）的影響

為了探討YTHDC2下調在NAFLD進展中的作用，作者通過抑 制正常小鼠肝臟中YTHDC2, 發現肝臟YTHDC2表達水平降低后肝臟及血漿TG含量明顯升高，同時Srebp-1c、Fasn、Scd1、Acc1、Gpat1等脂質基因RNA和蛋白水平表達均上調，而參與脂肪酸β-oxidation和脂質運輸相關基因并未受影響。細胞實驗也證實YTHDC2下調后跟體內實驗結果一致，而敲除Srebp-1c后YTHDC2缺乏癥的影響明顯被逆轉。這些數據表明YTHDC2下調導致甘油三酯沉積的關鍵，是促進其合成和累積，而下調Srebp-1c可能逆轉YTHDC2缺乏引起的效應。

圖7. YTHDC2的下調促進了肝內甘油三酯的積累

5. YTHDC2改善肝臟甘油三酯沉積

由于內源性YTHDC2下調促進了瘦小鼠肝臟脂質的積累，因此，作者進一步探討YTHDC2過表達是否可以緩解與肥胖相關的肝骨化。實驗結果發現在ob/ob小鼠經注射YTHDC2（ad-ythdc2）后肝臟TG下降，肝骨化明顯改善。顯然過表達YTHDC2明顯抑 制甘油三酯合成相關基因以及炎癥基因的表達，但沒有影響β-oxidation相關基因。通常NAFLD與胰島素抵抗和高 血糖密切相關，因此作者繼續探討YTHDC2過表達對ob/ob小鼠糖代謝的影響。事實上，ob/ob小鼠過表達YTHDC2可明顯降低禁食和飼養狀態下的血糖水平，也改善了對胰島素的耐受性。YTHDC2過表達對ob/ob小鼠增強對胰島素的敏感性證實是由于增強了肝臟中蛋白激酶和糖原合酶(GKS3β)的磷酸化以及降低葡萄糖異生酶的表達水平，同時Ythdc2的過表達改善了棕櫚酸或高糖誘導的TG積累和甘油三酯合成的基因表達，因此YTHDC2過表達可以改善NAFLD。

圖8. YTHDC2調節糖代謝的過程

6. YTHDC2調節甘油三酯代謝基因的mRNA穩定性

為了深入探討YTHDC2調節甘油三酯代謝基因的內在機制，結合前期研究YTHDC2可以識別特定的m6A甲基化修飾的基因，并影響mRNA穩定性從而調控基因表達，那YTHDC2是否也是同樣的調節作用？實驗結果表明YTHDC2的過表達或敲除并沒有影響整體m6A修飾水平，RIP-qPCR（云序可提供此服務）證實YTHDC2富集大量的甘油三酯合成相關基因Srebp-1c，Fasn，Acc1，scd1和Gapt1，其中Srebp-1c富集倍數遠超過其他基因30多倍，這表明YTHDC2能夠較強結合甘油三酯合成相關基因。此外，肥胖小鼠YTHDC2與脂肪基因mRNA的結合親和力明顯降低，熒光素酶報告實驗也證實Ythdc2過表達明顯降低了Srebp-1c基因3'UTR的熒光素酶報告活性。然而Srebp-1c m6A修飾位點突變消除了YTHDC2的抑 制作用，這表明YTHDC2能與Srebp-1c 3'UTR結合并通過加速mRNA的降解或干擾蛋白質的翻譯來調節Srebp-1c 的表達。YTHDC2的過表達或敲除能夠影響這些脂肪基因mRNA的壽命，綜合這些實驗數據，結果表明YTHDC2可以識別m6A修飾的甘油三酯合成基因，并與之3'-UTR結合，降低mRNA的穩定性從而調控基因表達，引起肝臟甘油三酯沉積和NAFLD的發生 發展。

圖9. YTHDC2調節甘油三酯代謝相關基因mRNA的穩定性

總結：

本文研究表明m6A修飾可調控肥胖相關疾病的發生，YTHDC2可以與經m6A修飾甘油三酯合成相關基因的mRNA結合并降低其穩定性，為肥胖相關NAFLD疾病的研究提供了新的方向。作者也是借用云序生物RNA-seq聯合m6A-seq技術，從而快速找到發生m6A修飾mRNA，鎖定發生m6A修飾的關鍵靶基因，揭示RNA修飾調節NAFLD發生 發展的分子機理，可謂是一步到位。本篇文獻能夠幫助科研者快速掌握RNA修飾的研究進展，協助各位探討RNA修飾在各自領域的重要生物學功能。

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