云序客戶解 密快速發表5分文章秘籍之RNA甲基化測序篇

文章導讀

如何快速發表5分左右文章，這是很多科研工作者頭 痛的問題，確實SCI 文章5分是個坎，尤其臨床醫生平時臨床忙成狗，哪有時間做實驗，功能不想做，機制不想做，有沒有創新套路？都說m6A RNA甲基化測序很火，做個測序就能發文章（案例一/案例二），那么，m6A RNA甲基化趕遲了怎么辦？天下武功唯快不破，m5C RNA甲基化表達譜教你如何快速發表5分左右文章。

首先介紹一下，什么是m5C RNA甲基化？

m5C RNA甲基化是胞嘧啶（C）的第五位N上加上甲基的一種修飾（C5-methylcytidine，m5C），它是近年來發現的一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾，利用高通量測序手段已驗證其在非編碼RNA及mRNA中也廣 泛存在。目前已證實其功能涉及調控干細胞應激、細胞毒性應激、mRNA出核和植物細胞發育及基因表達等方面。

下面小編為大家解析一篇云序客戶發表的關于m5C RNA甲基化的表達譜文章。該研究主要探究了m5C RNA甲基化轉移酶（NSUN2）對mRNA m5C甲基化修飾和基因表達的影響。下面看一下作者是怎么研究的？作者利用CRISP/Cas9技術構建NSUN2-/-HEK293細胞系，并利用m5C RNA甲基化測序和RNA-Seq（云序提供以上服務）檢測mRNA中m5C的修飾水平和基因表達水平。該研究一共檢測到1185個修飾位點和790個表達發生改變的基因。進一步生信分析揭示，發生m5C甲基化修飾能夠調節基因表達，并且這些差異表達基因能夠顯 著富集到與細胞增殖相關的信號通路上。同時作者還發現，下調NSUN2能夠顯 著抑 制HEK293細胞的增殖和遷移，其中GRB2和CD44可能是NSUN2調節細胞增殖的關鍵調節因子。該研究進一步闡述了NSUN2調控HEK293細胞增殖和遷移等生物學功能的分子機制。

發表期刊：Epigenomics

影響因子：4.404

實驗方法：m5C RNA甲基化測序、RNA-Seq（云序生物提供以上服務）

全文鏈接：Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells

文章內容

1、NSUN2影響m5C在HEK293細胞中整體分布情況

NSUN2被報道是RNA甲基轉移酶，能使tRNAs和mRNA發生m5C甲基化修飾。為了探究NSUN2對HEK293細胞mRNA m5C甲基化修飾的影響。作者利用CRISP/Cas9技術敲減NSUN2（NSUN2-/-HEK293細胞）后進行RNA-BisSeq。經過生信分析，發現在HEK293細胞有12442個m5C位點，在NSUN2-/-HEK293細胞中有3270個m5C位點，在注釋mRNA中分別有1142個和376個m5C甲基化位點（A）。且NSUN2下調能夠降低m5C甲基化程度（B）和部分染色體上m5C位點數目（C）。但是，NSUN2下調并不改變m5C位點的motif偏好性，HEK293細胞中，CG含有22%，CHG含有33%，CHH含有45%；NSUN2-/-HEK293細胞中，CG含有24%，CHG含有33%，CHH含有43%（C、D）。這些數據顯示，NSUN2能夠影響m5C位點在HEK293細胞中的分布。

2、NSUN2調節的差異m5C mRNA的功能預測

為了進一步探究NSUN2如何影響HEK293細胞功能。作者對發生差異m5C mRNA（DMGs ）進行了GO和KEGG注釋分析。GO注釋顯示這些DMGs與轉錄起始、mRNA分解代謝過程、RNA剪接、RNA輸出、mRNA穩定性調節及基因表達均有顯 著相關（A）。KEGG分析顯示與核糖體、剪接體、RNA運輸和凋亡通路以及PI3K-Akt信號通路顯 著相關（B）。這些結果說明，NSUN2調節的m5C甲基化可能通過RNA的合成和翻譯，進一步影響基因表達水平。

3、NSUN2對mRNA的表達水平的影響

為了探究NSUN2調節的m5C RNA甲基化對mRNA表達水平的影響，作者對NSUN2-/-HEK293和HEK293細胞進行了RNA-seq。結果顯示有790個差異表達的基因（DEGs），其中467 個上調，323 個下調（A）。為了進一步探究NSUN2對這些DEGs功能的影響，作者對DEGs進行了GO和KEGG注釋分析。GO注釋顯示這些DMGs與細胞黏附、神經系統發育、細胞表面受體信號傳導、細胞分化、細胞增殖均有顯 著相關（B）。

4、NSUN2能夠調節HEK293細胞的增殖和遷移

有研究報道NSUN2能夠促進一些ai癥細胞的增殖和遷移。為了進一步探究，NSUN2對HEK293細胞增殖和遷移的影響，作者進行MTT、克隆形成和劃痕實驗。結果顯示下調NSUN2能夠抑 制HEK293的增殖（A，B）和遷移（C）。

5、NSUN2能夠恢復NSUN2-/-HEK293細胞增殖和遷移能力

為了證明NSUN2確實影響HEK293細胞的功能，作者在NSUN2-/-HEK293細胞中過表達NSUN2后（A），進行MTT和劃痕實驗。結果展示NSUN2能夠恢復NSUN2-/-HEK293細胞增殖和遷移（B-C）。   

6、與細胞增殖和遷移相關的差異基因的表達譜

以上結果都證明NSUN2與HEK293細胞的增殖和遷移相關。為了探究與其相關的基因，作者通過GO注釋，發現了86個 DEGs與增殖相關（D）、57個 DEGs與遷移相關（B）、32個 DEGs與增殖和遷移相關（C）。    

7、PCR驗證與增殖和遷移相關的差異表達的基因

為了探究測序的可靠性，作者通過PCR探究了7個與增殖和遷移的關鍵基因（FN1, CD44, GRB2, TGFB1,ITGA3, THBS1的表達，跟測序結果一致（A）。同時，發現NSUN2能夠恢復NSUN2-/-HEK293中CD44, GRB2的表達（B）。這說明測序數據是可靠和可信的。

總結

RNA甲基化依然是當下生命研究競相追逐的科研熱點，本文作者的研究思路跟m6A的典型研究模式異曲同工。作者從m5C 甲基化酶（NSUN2）出發，并對其進行干預后，進行m5C RNA甲基化測序和RNA-seq，然后將表觀轉錄組學和轉錄組學進行聯合分析，探究該酶調控的靶基因，從而探究NSUN2通過影響基因表達參與HEK293細胞功能的調控。這種方法對于探究酶調控的靶基因，簡單快捷高效，且多組學聯合分析，文章內容豐富，可呈現的信息多樣，是目前通過酶研究甲基化的一大利器，受到眾多科研工作者的追捧。

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免疫共沉淀測序（MeRIP-seq）：利用m5C特異性抗體，通過免疫沉淀技術（MeRIP方法）特異性富集發生m5C修飾的RNA，與不處理組（Input）做對比，利用高通量測序特異性地檢測發生m5C修飾的RNA。

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云序作為一家依托于高通量測序的表觀轉錄組學科研服務公司，長期致力于提供優 質前沿表觀研究測序產品，繼m6A、m5C、m1A之后，云序隆重推出多款RNA新修飾，不僅m7G測序，還包括m3C測序、ac4C RNA乙?；瘻y序、2'-O-甲基化測序產品，打造了全 面的RNA修飾研究平臺。

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