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云序客戶8.0分成果揭秘：還愁lncRNA功能機制如何研究嗎？看這里！
LncRNA是長度大于200nt的長鏈非編碼RNA，在調控不同的分子過程中發揮著重要作用。其主要功能不僅可以與功能蛋白結合，并在轉錄或轉錄后水平調控基因表達，而且lncRNA也可以作為誘餌，吸附miRNA，調節miRNA調控的靶基因表達。但是，目前關于lncRNA在胃ai中的表達譜和生物學功能的了解仍然有限；在本研究中，作者首先通過生物信息學分析胃ai lncRNA微陣列數據庫，發現LINC0034在胃ai中明顯高表達，且與胃ai具有臨床相關性，結果顯示顯示LINC00346在胃ai中反復擴增上調，其表達與病理分期差、腫 瘤體積大、預后差呈正相關。然后探究了 LINC00346的體內外功能，實驗顯示LINC00346能夠影響胃ai生長、遷移和侵襲等生物學功能。作者也探究了LINC00346調控胃ai發展的上下游分子機制，上游機制顯示致ai轉錄因子KLF5和MYC可與LINC00346啟動子結合，并增強其表達；下游機制顯示LINC00346主要表達在胞質中，可通過ceRNA機制作為miR-34a-5p的分子海綿體，并通過吸附miR-34a-5p后調節其下游靶基因CD44、AXL、NOTCH1的表達并調控胃ai細胞的生物學功能。
綜上所述，該研究結果證明了KLF5、MYC/LINC00346/miR-34a-5p在胃ai發生 發展中起關鍵作用的模型，為胃ai治 療提供了新方向和思路。
影響因子：12.067
實驗方法：生信分析，轉錄組RNA測序，RIP，pulldown（云序生物提供）
測序樣本：過表達LINC00346的胃ai細胞（實驗組），轉染空載質粒的胃ai細胞（對照組）
a,b：LINC0034在胃ai中明顯高表達；c-d：LINC0034的表達與病理分期差、腫 瘤體積大、預后差呈正相關。
a-b．克隆形成實驗探究細胞增殖能力；c. 流式細胞術實驗探究細胞周期組織情況；d. EDU免疫熒光染色實驗探究細胞增殖能力；e. Transwell和invasion實驗探究細胞遷移和侵襲能力。
a-h：裸鼠成瘤實驗
結果：轉錄因子KLF5和MYC可與LINC00346啟動子結合，并增強其表達
a. 轉錄因子MYC、KLF5和 LINC00346的Oncoprint分析；b. 在含有或未含有胃ai KLF5/ MYC / LINC00346 SCNAs的轉錄因子KLF5、MYC、LINC00346基因表達；c. GSE51705數據庫的分析顯示，KATO-III GC細胞中KLF5與LINC00346基因啟動子結合；d. UCSC基因組生物信息學網站顯示， MYC高度富集在LINC00346的啟動子上；e. GSE51575數據庫顯示LINC00346的表達與KLF5或MYC正相關；f. qPCR顯示LINC00346的表達與KLF5或MYC 正相關；g. ChIP實驗顯示，內源性MYC和KLF5與LINC00346基因啟動子區結合。h. WB顯示干擾或過表達LINC00346后，KLF5和MYC蛋白表達情況；i. 雙熒光報告實驗檢測LINC00346啟動子片段與KLF5或MYC直接結合
結果1：GSEA和GO分析LINC00346高/低表達胃ai患者和細胞
a. GSEA分析GSE65801數據中比較LINC00346高/低后差異基因的富集信號通路； b. 熱圖顯示胃ai中過表達LINC00346后的差異基因；c. GO分析差異基因的富集情況；d,e. qPCR和WB篩選腫 瘤相關的差異基因。
a.IHC分析腫 瘤組織和腫 瘤肺轉移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；b. qPCR檢測胃ai發生或未發生淋巴結轉移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；c. IHC檢測胃ai發生或未發生淋巴結轉移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；d. WB檢測胃ai細胞中Notch1, CD44, 和AXL的蛋白表達；e,f. Transwell實驗檢測Notch1, CD44 或 AXL對LINC00346侵襲功能的挽救能力；g. MTT和h.克隆形成實驗檢測Notch1, CD44 或 AXL對INC00346增殖功能的挽救能力。
a. LINC00346和miRNA結合位點的預測；b. MS2-RIP實驗驗證LINC00346能夠拉下的miRNAs；c. pull-down實驗驗證LINC00346吸附的miRNAs；d. 雙熒光報告基因實驗miR-34a與LINC00346直接結合；e. AGO2 RIP實驗驗證miR-34a能夠拉下LINC00346；f. WB顯示miR-34a能夠挽救LINC00346對Notch1, CD44 或 AXL的蛋白水平的調節；g. Tranwell實驗顯示miR-34a能夠挽救LINC00346對胃ai細胞遷移和侵襲能力的調節；h. 雙熒光報告基因實驗顯示miRNA能與Notch1, CD44 或 AXL基因的3‘UTR直接結合； i. 原位雜交實驗顯示LINC00346和miR-34a能夠共定位在細胞質中。
本研究通過生物信息學分析、功能實驗和分子機制探究實驗技術揭示了胃ai發展中一個潛在的新機制：在胃ai的發展過程中，轉錄因子KLF5和MYC結合LINC00346啟動子區，并促進其表達；在胃ai中高表達的LINC00346主要定位在胞質中，并競爭性吸附miR-34a-5p，抑 制miR-34a-5p對其下游靶基因（Notch1, AXL, 和CD44）的調控，導致了胃ai的惡化發展。LINC00346對胃ai細胞的促增殖和轉移的多效性作用提示LINC00346可作為胃ai的有效治 療靶點。
https://doi.org/10.1038/s41418-018-0236-y
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